产品货号:
ALH152
中文名称:
酵母基因组DNA提取试剂盒
英文名称:
Yeast genomic DNA rapid extraction kit
产品规格:
50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,用于提取酵母细胞中的基因组DNA。无需酚氯仿等有毒试剂,也无需进行耗时的醇类沉淀,最大限度的去除蛋白及其他抑制性杂质。提取的DNA可直接用于酶切、PCR、Southern Blot等实验。
- 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。
- 快速,简捷,单个样品裂解后操作一般可在30min内完成。
- 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9。
组分 | 规格 | 保存条件 |
平衡液 | 5mL | 室温 |
缓冲液SE | 15mL | |
缓冲液YB | 10mL | |
结合液CB | 11mL | |
抑制物去除液IR | 25mL | |
漂洗液WB | 13mL | |
洗脱缓冲液EB | 15mL | |
吸附柱AC | 50个 | |
收集管(2mL) | 50个 | |
Lytic Enzyme | 2.5mL | -20℃ |
蛋白酶K溶液 | 1mL | 4℃ |
保存:按标签指示条件保存,有效期1年。
- 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
- 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中,常温运输。收到后,不超过25℃室温至少保存6个月,4℃保存12个月,-20℃保存2年。
- Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液,因此比较粘稠,请小心取用,-20℃保存。蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶,它含有纤维素酶,
果胶酶,淀粉酶,蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。 - 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
- 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
- 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1~2×107cells/ml,由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大,以上仅供参考。
- 需要自备乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇。
- 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中按照标签指示加入无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
- 吸取使用量的缓冲液SE加入0.2% β-巯基乙醇,备用。
- 平衡液预处理吸附柱备用:使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见附录参考“关于平衡液的使用”
- 取1~3mL酵母培养物(不超过3×107 cells,最好是早对数生长期),13000rpm离心30sec,尽可能的吸弃上清,收集菌体。
- 收集超过1.5mL菌液,可以离心弃上清后,在同一个1.5mL管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
- 加入300μL缓冲液SE,轻柔吹打充分重悬细胞;再加入50μL Lytic Enzyme储液,充分颠倒混匀,37℃温育1~3小时消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。
- 如果破壁效果不好导致产量低,可以加大lytic Enzyme用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果,不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它酶消化或0.5mm玻璃珠涡旋击打,反复冻融等。
- 玻璃珠法:向菌体中加入180μL缓冲液YB彻底悬浮菌体,加入0.1g直径为0.45~0.55mm的酸洗玻璃珠,涡旋振荡10min,静置几分钟让玻璃珠沉淀,小心吸取上清到一个新管后接后续步骤4。
- 如果破壁效果不好导致产量低,可以加大lytic Enzyme用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果,不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它酶消化或0.5mm玻璃珠涡旋击打,反复冻融等。
- 13000rpm离心1min,尽可能吸弃上清,加180μL缓冲液YB充分重悬细胞团。
- 加入20μL的蛋白酶K溶液,立刻涡旋振荡充分混匀。
- 将混合物放置在55℃水浴消化直到消化完全,期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
- 所需消化时间和酵母数量、种类和生长状态有关,一般15min即可,但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。
- 可选步骤,一般不需要:如果RNA残留较多,需要去除RNA,可在完成操作步骤5后加20μL RNase A(10mg/mL)溶液,振荡混匀,室温放置5~10min。
- 所需消化时间和酵母数量、种类和生长状态有关,一般15min即可,但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。
- 加入200μL结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,70℃放置10min。
- 冷却后加入100μL异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
- 上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15sec混匀。
- 加入500μL抑制物去除液IR,13000rpm离心30sec,弃废液。
- 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),13000rpm离心30sec,弃废液。重复步骤9一遍。
- 将吸附柱AC放回空收集管中,13000rpm离心2min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50~100μL洗脱缓冲液EB,室温放置3~5min,13000rpm离心1min。
- 洗脱缓冲液事先在80~100℃水浴中预热可以提高产量。
- 可将第一次洗脱所得溶液重新加入离心柱中,室温放置2min,13000rpm离心1min。可以提高浓度10%左右。
- 洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于30μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
- DNA可以存放在-20℃,如果要长时间存放,可以放置在-70℃。
关于平衡液的使用:
- 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
- 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm离心1min,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
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